On crystallising the "high-hunging fruits" - collection of unusual strategies for protein crystallisation

For long has it been believed that the process of macromolecular crystallisation is stochastic - one is completely at mercy of the target protein.

The development of modern techniques are about to change this however, by directly addressing the inherent "crystallisability" of the proteins. Furthermore, there has been developments from other direction which I believe is noteworthy. Here I will make a collection of publications and notes about several unusual strategies in protein crystallisation pridominantly as a note for myself, but I hope it will be of use to whoever forwarded here by search engines. I will attempt the contradictory - keep it brief while maintaining the core information that distinguishes each of them.

Surface entropy reduction strategy
This method will directly address the crystallisability of the protein by creating a crystal contact patch on the surface of the protein. Crystallisation may be regarded as a chemical reaction where the lower the Gibb's free is, the better it proceeds. Some amino acids such as Glumate and Lysine will provide negative conformational entropy if they are to be stabilized during crystallisation. Now, negative of a negative will contribute positively to the overall Gibb's free energy.

This approach is my personal boom. This will be relevant and applicable in many situations because the majority of the difficult protein in progress will be cytoplasmic (they would have been chosen on an assumption that cytoplasmic protein will be easier to crystallise). Application of this technique to a membrane protein has shown success too.

Supply crystal contact sites
This approach is somewhat akin to the method above in the sense that crystal contact site is artificially introduced. This may be applicable to both cytoplasmic and membrane proteins.

For cytoplasmic proteins that are hard to "tame", it is an usual approach to add a tag such as MBP or GST to the protein to increase its solubility/stability. Usually the expression and purification is followed by the cleavage of the tag, but in this review, the authors discuss the approach to crystallisation with the tag intact. This has advantages such as shorter purification steps (no cleavage condition optimisation and separation) and additional source of phase information via molecular replacement. The drawback of potential flexibility between the tag and the target protein is addressed by opting for an inflexible linker comprising of polyalanine chain over the usual protease target sequence. The length of the linker is subject to optimisation.

Membrane proteins may be inherently less susceptible to crystallisation than cytoplasmic proteins. The solublisation of the membrane protein involves the use of detergents which forms vesicles whose radius is substantial relative to the dimension of the protein. The polar surface available as crystal contact site is hence potentially limited, and perhaps this also rationalise the more fragile nature of membrane protein crystals. In a recent structural report of highly anticipated GPCR - G-protein complex, the authors report the multitudes of techniques to overcome the problem. Llama nanobody was used to stabilise the flexible apo-form of the alpha subunit, but the interesting part for me is the incorporation of T4-lysozyme in between the transmembrane helices which served as crystallisation tag that sticks out of the vesicle and provide inter-protein contact areas.

Low gravity crystallisation
Low-gravity environment in the space has opened up possibilities for many novel experiments, as well as obtaining better macromolecular crystallisation. Those who can't afford such an expensive experimental set-up need not despair, however. A strong magnetic field that mimic the low-gravity environment has been shown to promote crystallisation of lysozyme. Sound excellent, though to what extend will this be practical is questionable. I personally have not seen any follow-ups to the New Scientist article above which is dated August 2007, but it could just have been me missing it.

Laser induced crystallisation
Exposing the crystallisation drop to circularly polarized light at 532nm has been reported to promote crystallisation. The effect to protein solubility has also been reported too.

野郎どもの需要 - iPS細胞から精子を作って生殖を行うことに成功

最近特に気になったニュースがあるのでネタにしようかと思います。

iPS細胞から精子を作って生殖を行うことに成功

体の分化した細胞を受精卵のごとく、いろんな種類の組織になりえるよう「若返らせる」、iPS細胞の技術ですが、今回iPS細胞より精子細胞を作製することに成功したそうです。

単純に分かりやすくてすごいと思います。成長とは、受精卵から各々の細胞が目的となる組織になるために特殊化してゆく、分化というプロセスを行うのですが、長らくはこれは一方向にか進まないプロセスだと思われていました。しかし、分化した細胞に4っつの遺伝子を導入することにより、元通りいろんな細胞になりえるポテンシャルを持つiPS細胞に変化させるテクニックが確立されたのは2006年でした。

そして今回はそのiPS細胞を精子細胞に変化させることができるようになったというのは、細胞のプログラミングのメカニズムがさらに詳しくわかったということでしょう。まだ論文を読んでいないのですが、分化した細胞より作られたiPS由来の精子細胞とはいえ、元となる分化した細胞には23ペア、合計46個の染色体があるはず。iPS細胞が精子細胞になるにあたり、必ずMeiosis（減数分裂注１)を行わなければならないので、元の分化細胞のソースはやはりオスの個体なのでしょうか。

汗）いや、今度こそ確実に社会から男性が全く必要なくなるテクノロジーが開発されてしまったかと思いましたよ、ハハハ。現在でもすでに精子バンクなどはありますが、在庫には限りがあります。今回のiPS細胞から精子を作るというのも、上記のとおりならオスの個体が必要なはず。ということで生殖目的にはまだオスの需要は続きそうです（注2）。



注1：受精卵の染色体は父親から23個、母親から23個もたらされ、合計46個、もしくは23ペアとなります。23ペア目の染色体は性染色体と呼ばれ、赤ちゃんの性を決定します。母親からは常にX染色体がもたらされるのですが、父親からはYもしくはXがもたらされ、Yの場合は男、Xの場合は女になります。繁殖の際、46個の染色体は半減分裂というプロセスを経て、2つの23に分かれ、上記のとおり男と女が23個づつ提供します。

注2：クローンという力技がないわけではありませんが、通常の生殖細胞から子供を作る場合の話です。

犬の砲撃と連想

人間の脳とは面白いもので、たとえほとんど関係がないものでも、以前の記憶との類似点を見つけ、思い出すことができる。とあるペットのハプニング映像を見て、自分が最初に連想したのがAC-130というアメリカの攻撃機だった。

まずは以下のGIF映像を見てほしい。

点火した花火を犬がとっさに咥え、そのまま走り出す。注目すべきは花火が左向きに発射され、人がそれを避けようとしているところだ。
これを見て自分が連想したのがAC-130。映画トランスフォーマーでその活躍が描かれている。

輸送機であるC-130に戦車の大砲を左向きにくっつけた飛行機だ。常に左に旋回しながら対地砲撃をする。

犬が咥えた花火が右向きに発射されていたらAC-130を連想しなかっただろう....という空想なのか、それとも脳の不思議な働きに感心すべきなのかよくわからないところで今回はおしまいです。